منتدي طلاب التقانة الحيوية بجامعة امدرمان الاسلامية

نرحب بكم في منتدي طلاب التقانة الحيوية و نتمني ان تجدوا ما يعجبكم و يفيدكم
منتدي طلاب التقانة الحيوية بجامعة امدرمان الاسلامية

تجمع طلابي يهدف لرفع الوعي بعلم التقانة الحيوية و العلوم المتصلة بها


    صبغ البكتريا

    شاطر
    avatar
    مجاهد ادريس

    المساهمات : 164
    تاريخ التسجيل : 24/02/2010
    العمر : 26
    الموقع : we.ja2009@hotmail.com

    صبغ البكتريا

    مُساهمة من طرف مجاهد ادريس في الإثنين أبريل 19, 2010 8:20 am







    الدرس العملي السادس : صبغ البكتيريا
    THE STAINING OF BACTERIA






    يمكن إجراء الفحص المورفولوجي morphology لخلايا البكتيريا بطريقتين :

    1- بفحص الخلايا الحية دون صبغها ، كما يحدث في فحص حركةmotility البكتيريا.

    2- بفحص الخلايا الميتة المصبوغةstained بالصبغات.

    والبكتيريا الحية عديمة اللون تقريباً ، وتباينها مع الوسط المائي المعلقة به لا يكفي لرؤيتها بوضوح، لذلك فإن صبغ البكتيريا يجعلها تتباين contrast في اللون عن الوسط الموجودة به ، فتصبح مرئية visible ويسهل تمييزها . كما تستعمل أيضاً بعض الصبغاتdyes لتمييز التركيبات الداخلية للخلايا internal structures والتي بدون صبغها تكون غير مرئيةinvisible وبالإضافة إلى ذلك ، فإنه لكي تستخدم العدسة الزيتية oil immerging lens في الفحص للوصول إلى أكبر درجة تكبير ، فإنه من الأنسب استعمال تحضيرات مصبوغة stained preparations عن استعمال التحضيرات المبتلةpreparations wet mounts . رغم أن البكتيريا لا تبدو مختلفة بدرجة كبيرة عن الوسط المحيط بها ، إلا أنها تختلف عنه كثيراً من الناحية الكيميائية ، هذه الاختلافات الكيميائية بين البكتيريا والوسط ، هي التي تمكننا من تمييز البكتيريا بواسطة الصبغ . فالصبغة تتحد غالباً مع الخلية البكتيرية وليس مع الوسط المحيط.



    وعلى ذلك فإن المزايا الرئيسية للصبغ هي :

    1- توفير التباينcontrast بين الكائنات الدقيقة micro-organisms وبين الخلفية الموجودة فيها Background ، مما يسمح بالتمييز بين الأنواع المورفولوجية المختلفة morphology.

    2- تسهيل دراسة التركيبات الداخلية internal structures للخلايا البكتيرية ، مثل : جدار الخلية cell wall، والأجسام النوويةnuclear bodies ،والجراثيم spores في الأنواع المتجرثمة.

    3- تمكين البكتريولوجي من استعمال قوة تكبير أعلى higher magnification power.

    وتستخدم الأنواع المختلفة من الصبغات dyes المتاحة الآن للعاملين في مجال البكتريولوجي , بطرق متعددة للصبغ الأساسي basic staining :

    1-الصبغ البسيط simple stain

    ( أ ) صبغات قاعدية basic dye ( ب ) صبغات حامضيةacidic dyes

    ( ج ) صبغات غير محددة التأثير indifferent dye

    2- الصبغ المركب ( التفريقي ) compound ( differential ) stain

    مثل

    ( أ ) صبغة جرام Gram stain

    3- صبغ تراكيب الخلية structural stain ( ب ) صبغة الجراثيم الداخلية endospore stain



    وقبل إجراء عملية الصبغ ، يجب أن نثبتfix المادة التي سنفحصها، بمعنى أن تلتصق المادة بسطح الشريحة التي سنصبغ عليها. وإذا لم يثبت التحضير ، فإن غشاء Film الخلايا سيزول من على الشريحة أثناء عملية الصبغ.

    تحضير وتثبيت الغشاء البكتيري للصبغ
    Preparation and Fixation of Bacteria for Staining




    أهمية التثبيت :

    - يؤكد التصاق adhesion الخلايا البكتيرية على الشريحة الميكروسكوبية .

    - يقتل الخلايا المثبتة .

    - يغير طبيعة أنزيمات الخلية وذلك يمنعها من هضم أجزاء الخلية الذي قد يؤدي إلى التحلل الذاتي autolysis وفقد العينة .



    طرق التثبيت :

    أ- تثبيت بالحرارة heat fix:

    ويتم إما بتمرير الشريحة على لهب بنزن Bunsen burner عدة مرات _ ويراعى أن استعمال الحرارة أكثر من اللازم سيشوه شكل وتركيب الخلية المصبوغة ، لذا يجب أن تكون الشريحة دافئة وليست ساخنة _ أو بوضع الشريحة على مسخن الشرائح slide warmer ( hot plate ) عند 60ºم لمدة عشر دقائق .

    ب- تثبيت كيميائي chemically fix:

    بوضع كحول ميثيلي methyl alcohol 95% لمدة دقيقة ثم نميل الشريحة للتخلص من الكحول الفائض .



    طريقة العمل PROCEDURE :

    والطريقة العامة الموضحة في هذا التدريب ، تعتبر أساسية في معظم طرق الصبغ المستعملة للبكتيريا . ففي هذا التدريب سنستعمل الحرارة لقتل الخلايا وتثبيتها على الشريحة.



    1- نمرر سطح شريحةslide نظيفة في لهب بنزن Bunsen عدة مرات للتعقيم الجزئي ولإزالة ما يكون عالقاً بها من حبيبات دهن، ثم نتركها على حاملها لتبرد.

    2- أ* بواسطة الإبرة ذات العقدةinoculating loop ، نضع غمستينtow loop full أو ثلاث من المزرعة السائلة على سطح الشريحة

    ب* وفي حالة المزرعة الصلبة ، نضع نقطة ماء نظيفة في وسط الشريحة . ثم نأخذ جزءاً صغيراً من النمو البكتيري بواسطة الإبرة ذات العقدة inoculating loop ونمزجهما جيداً .

    3- ننشر بالإبرة مزيج المزرعة الصلبة ( أو غمسه المزرعة السائلة ) على مساحة حوالي 1سم بوسط الشريحة ، لتكون غشاء رقيق thin film منتظم.

    4- نترك الغشاء ليجف تماما في الهواء air dry على درجة حرارة الغرفة. أو بمسك الشريحة أعلى اللهب بحوالي 20cm بحيث لا يغلي الغشاء الموجود على الشريحة.

    5- بعد ذلك نثبت الغشاء المتكّون بتمرير الشريحة في اللهب عدة مرات ( نراعي أن يكون سطح الشريحة الذي عليه الغشاء متجها باستمرار إلى أعلى ) .














    *ملاحظات

    - لتنظيف أي شريحة نستخدم المواد المنظفة أو الكاشطة مثل الصابون abrasive soap ثم نغسل ونجفف الشريحة . أو يمكننا أن نضع قطرة من الزّيلين xylene ( xylol )على سطح الشريحة ثم ننظف بقطعة قماش.

    - إذا كانت الشريحة نظيفة فانه يمكن فرد المعلق على سطحها بانتظام ، أما الشريحة غير النظيفة فإن المعلق يتجمع على سطحها بشكل قطرات متفرقة ولا يتكون غشاء منتظم .

    - تمسك الشريحة بالأصابع من حوافها حتى لا يعلق بها أي مواد دهنية موجودة بالأصابع .

    والتثبيت النموذجي هو الذي يحفظ تركيبات الخلية في شكلها ووضعها الطبيعي ، دون حدوث تشوهات ، أو ظهور تركيبات لم تكن موجودة بالخلية الحية .

    وبعد تثبيت الغشاء نقوم بعملية الصبغ stain، ونبدأ بالصبغ البسيط .



    1- الصبغ البسيط simple stain :

    يقصد به استعمال صبغة مفردة في صبغ الخلايا.

    - ويعتمد الصبغ البسيط على حقيقة أن خلايا البكتيريا تختلف كيميائياً عن الوسط المحيط بها ، لذلك فإنها تصبغ لإظهار التباين بينها وبين الوسط.

    - ويفيد في توضيح الفروق الموجودة في حجم الخلايا cell size، وشكلها morphology ، ونظام تجمعها arrangement.

    * الصبغ البسيط الذي يستهدف الخلايا البكتيرية ذاتها يسمى الصبغ المباشر direct stain

    * الصبغ البسيط الذي يصبغ الخلفية ويترك الخلايا البكتيرية غير مصبوغة

    يسمى الصبغ السالب negative stain



    الصبغ بالصبغات القاعدية Staining With Basic Dyes :



    قد تستعمل لصبغ البكتيريا الصبغات القاعدية مثل : صبغات أزرق الميثيلين Methylene blue ، أوالكريستال البنفسجي Crystal violet ، أو كربول الفوكسين Carbol fuchsin ، أو السفرانين Safranin ، ورغم أن كل هذه الصبغات قاعدية إلا أنها تختلف عن بعضها في مدى درجة صبغها للخلية . فأزرق الميثلين والسفرانين أكثر بطأ في تفاعلهما مع الخلية السالبة الشحنة ، حيث يحتاج كل منهما 30-60 ثانية لصبغ الغشاء الميكروبي ، بينما الكريستال البنفسجي أكثر فاعلية ونشاطاً ، ويحتاج عادة لحوالي 10 ثوان .

    فالشحنة السائدة على خلية البكتيريا هي نتيجة لتأثير حموضة الوسط الموجودة فيه . لذلك فإن خفض حموضة الوسط ( أي زيادة الرقم الأيدروجيني ) ، يزيد من مقدار الشحنة السالبة على الخلية مسبباً قوة جذب أكبر للصبغات القاعدية ، والعكس صحيح بالنسبة للصبغات الحامضية ، لذلك فإن الصبغ بالصبغات القاعدية يكون ضعيفاً عند رقم أيدروجيني منخفض ، بينما يكون الصبغ ضعيفاً بالصبغات الحامضية عند رقم أيدروجيني مرتفع.



    طريقة العمل PROCEDURE :

    1- نضع الشريحة التي عليها الغشاء المثبت – الذي سبق تحضيره في بداية هذا التمرين – على سلك للصبغ بأسفله حوض.

    2- نغمر الغشاء بالصبغة المطلوبة ، ونتركها وقتاً كافياً للتفاعل : 30 ثانية لأزرق الميثيلين أو السفرانين ، و 10 ثوان للكريستال البنفسجي .

    3- نتخلص من محلول الصبغة ثم نغسل الغشاء المصبوغ بالماء ، وذلك لإزالة الصبغة الزائدة.

    4- نجفف الشريحة بوضعها بين ورقتي نشاف نظيف ثم تمرر أعلى اللهب عدة مرات.

    5- نضع نقطة من زيت السيدر على الغشاء المصبوغ ثم نفحص بواسطة العدسة الزيتية high-power ( oil-immersion ) lens.

    ( إذا كان الغشاء المحضر سميكاً ، فسيظهر الغشاء المصبوغ ككتل متجمعة من مادة مصبوغة مع قليل جداً من الخلايا الفردية.)



    طريقة فحص الغشاء باستعمال العدسة الزيتية :

    1- توضع الشريحة على مسرح الميكروسكوب.

    2- يضبط الضوء بالاستعانة بالعدسة الشيئية الصغرى والمكثف حتى يشاهد المجال الميكروسكوبي ومنطقة الغشاء مضاء إضاءة عالية ومتجانسة .

    3- توضع نقطة زيت سيدرoil على الغشاء ثم تحرك القطعة الأنفية لوضع العدسة الزيتية في وضع الاستعمال ويدار الضابط الكبير حتى تنغمس العدسة في نقطة الزيت وتلامس سطح الشريحة ، يجب أن لا يدار الضابط بسرعة حتى لا تنكسر الشريحة . ونقوم بهذه الخطوة ونحن نراقب الشريحة والعدسة الزيتية من الخارج .

    4- ننظر من خلال العدسة العينية ونحرك الضابط الدقيق لرفع أنبوبة الميكروسكوب إلى أعلى حتى نرى الخلايا البكتيرية بوضوح .



    2- الصبغ المركب (التفريقي) compound(differential) stain

    - الصبغ المركب :لأننا تستعمل في هذه الطرق أكثر من صبغة واحدة .

    - الصبغ التفريقي : لأنه طريقة للتمييز، والتفرقة بين أنواع البكتيريا ،حيث تختلف الكائنات فيما بينها كيميائياً وفيزيائياً ، ولذلك فإنها تتفاعل بدرجات مختلفة بالنسبة لطريقة صبغ معينة ، وهذا هو الأساس الذي يعتمد عليه الصبغ التفريقي . وتعتبر صبغة جرام من أهم طرق الصبغ المركب المتبعة في الدراسات البكتيريولوجية .




      الوقت/التاريخ الآن هو السبت نوفمبر 18, 2017 2:10 pm